ASCH VAPOSCAN 經(jīng)皮水分流失儀助力AD屏障恢復(fù)研究

摘要

特應(yīng)性皮炎以慢性炎癥、屏障功能障礙和瘙癢為特征，搔抓等外界刺激會(huì)加重上述癥狀。

2024年11月，九州大學(xué)醫(yī)學(xué)研究生院皮膚科的Takeshi Nakahara等研究團(tuán)隊(duì)在《International Journal of Molecular Sciences》期刊上發(fā)表了題為“Extracellular ATP Contributes to Barrier Function and Inflammation in Atopic Dermatitis: Potential for Topical Treatment of Atopic Dermatitis by Targeting Extracellular ATP"的研究。該研究探討了細(xì)胞外三磷酸腺苷在特應(yīng)性皮炎病理生理中的作用，并評(píng)估了ATP釋放抑制劑氯膦酸鹽對(duì)特應(yīng)性皮炎的藥物潛力。

研究表明，細(xì)胞外ATP會(huì)降低角質(zhì)形成細(xì)胞中絲聚合蛋白的表達(dá)，而絲聚合蛋白是維持皮膚屏障完整性的關(guān)鍵蛋白，因此細(xì)胞外ATP會(huì)損害皮膚屏障功能。此外，白細(xì)胞介素-4和機(jī)械刺激會(huì)觸發(fā)ATP釋放，進(jìn)而促進(jìn)免疫細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子和趨化因子，加劇炎癥反應(yīng)。氯膦酸鹽可通過(guò)抑制ATP釋放，恢復(fù)角質(zhì)形成細(xì)胞中的絲聚合蛋白水平，減少樹(shù)突狀細(xì)胞產(chǎn)生胸腺活化調(diào)節(jié)趨化因子，并改善特應(yīng)性皮炎小鼠模型的癥狀。這些發(fā)現(xiàn)表明，靶向細(xì)胞外ATP有望成為改善特應(yīng)性皮炎皮膚屏障功能和減輕炎癥的新研究策略。未來(lái)研究應(yīng)進(jìn)一步探索靶向ATP在臨床場(chǎng)景中的長(zhǎng)期療效與安全性。

研究材料與儀器

材料

細(xì)胞、ATP、IL-4、氯膦酸鹽、MC903、熒光素-熒光素酶試劑、TRIzol試劑、RNeasy Plus Micro Kit、PrimeScript RT 試劑試劑盒、TB Green Premix Ex Taq、鼠源CCL17/TARC ELISA試劑盒、中性福爾馬林、乙醇、Dulbecco氏磷酸鹽緩沖液

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：8周齡雌性C57BL/6小鼠

儀器

熒光素-熒光素酶檢測(cè)相關(guān)設(shè)備、DTX 800多模式檢測(cè)儀、CFX Connect實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)、數(shù)字卡尺、蘇木精-伊紅染色相關(guān)設(shè)備、ASCH VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測(cè)量?jī)x、GraphPad PRISM 5軟件。

 ASCH VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測(cè)量?jī)x

實(shí)驗(yàn)過(guò)程

體外實(shí)驗(yàn)

1. 細(xì)胞培養(yǎng)：正常人類表皮角質(zhì)形成細(xì)胞在添加牛垂體提取物、重組人表皮生長(zhǎng)因子等成分的KGM-Gold培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)70%–80%時(shí)傳代，取第三代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)處理。分離C57BL/6小鼠骨髓細(xì)胞，在含粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，第10天收集非貼壁細(xì)胞，通過(guò)CD11c免疫磁珠陽(yáng)性分選獲得純度95%–97%的骨髓來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞。

2. 體外角質(zhì)形成細(xì)胞劃痕模型建立：將正常人類表皮角質(zhì)形成細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞形成完整單層后，用1000μL移液槍頭劃痕，劃痕后孵育15分鐘用于檢測(cè)細(xì)胞外ATP，孵育24小時(shí)用于熒光定量PCR檢測(cè)。

3. 細(xì)胞外ATP濃度測(cè)量：收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，離心后取上清，加入熒光素-熒光素酶試劑，通過(guò)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)ATP濃度。

4. 熒光定量PCR檢測(cè)：提取細(xì)胞或小鼠耳部皮膚組織的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用TB Green Premix Ex Taq進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)絲聚合蛋白、TARC及各類細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)水平。

5. 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)：收集骨髓來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞培養(yǎng)上清液，使用鼠源CCL17/TARC ELISA試劑盒檢測(cè)TARC蛋白含量。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

1. 塵螨抗原誘導(dǎo)的小鼠特應(yīng)性皮炎模型建立：將小鼠分為對(duì)照組、特應(yīng)性皮炎組、特應(yīng)性皮炎+氯膦酸鹽組。特應(yīng)性皮炎組和特應(yīng)性皮炎+氯膦酸鹽組小鼠雙耳涂抹含MC903的乙醇溶液，5小時(shí)后特應(yīng)性皮炎+氯膦酸鹽組涂抹氯膦酸鹽溶液，特應(yīng)性皮炎組涂抹溶媒；對(duì)照組涂抹乙醇。連續(xù)5天上述處理后，兩組均每日涂抹對(duì)應(yīng)試劑至第10天。

2. 小鼠耳部厚度測(cè)量：每日使用數(shù)字卡尺測(cè)量小鼠耳部厚度，記錄變化情況。

3. 組織學(xué)檢查：取小鼠耳部皮膚，用10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋、切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，觀察表皮厚度和真皮內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況，統(tǒng)計(jì)炎癥細(xì)胞數(shù)量和表皮厚度平均值。

4. 經(jīng)表皮失水量測(cè)量：使用ASCH VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測(cè)量?jī)x，在標(biāo)準(zhǔn)溫濕度環(huán)境下測(cè)量小鼠皮膚病變部位的經(jīng)表皮失水量。

使用Vapo Scan儀器在第0、2、4、6天測(cè)量病灶處 TEWL

5. 統(tǒng)計(jì)分析：所有數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用單因素方差分析結(jié)合Bonferroni多重比較檢驗(yàn)分析組間差異，P＜0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)論

細(xì)胞外ATP會(huì)降低角質(zhì)形成細(xì)胞中絲聚合蛋白的表達(dá)，損害皮膚屏障功能；IL-4和搔抓等機(jī)械刺激會(huì)促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞釋放ATP，進(jìn)而加劇特應(yīng)性皮炎的炎癥反應(yīng)。而氯膦酸鹽可通過(guò)抑制囊泡核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來(lái)阻斷ATP釋放，能夠恢復(fù)IL-4或搔抓導(dǎo)致的絲聚合蛋白表達(dá)下降，減少樹(shù)突狀細(xì)胞產(chǎn)生TARC。外用氯膦酸鹽可改善塵螨抗原誘導(dǎo)的特應(yīng)性皮炎小鼠模型的耳部腫脹、紅斑、鱗屑等癥狀，降低表皮厚度和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度，改善皮膚屏障功能。靶向細(xì)胞外ATP有望成為特應(yīng)性皮炎研究新方向，既能改善慢性癥狀，也可能緩解由外界刺激引發(fā)的急性加重癥狀。

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