武漢大學(xué)湯柳研究團(tuán)隊(duì)在木犀草素抗特應(yīng)性皮炎分子機(jī)制的研究進(jìn)展

摘要

來(lái)自武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部湯柳和周本宏研究團(tuán)隊(duì)在《Drug Design, Development and Therapy》（IF：5.1）期刊上發(fā)表了題為“Molecular Mechanisms of Luteolin Against Atopic Dermatitis Based on Network Pharmacology and in vivo Experimental Validation"的研究。該研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方式，探究了木犀草素抗特應(yīng)性皮炎的潛在分子機(jī)制，為木犀草素的臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

該研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，揭示了木犀草素抗特應(yīng)性皮炎（臨床以復(fù)發(fā)性濕疹樣皮損和劇烈瘙癢為特征）的潛在分子機(jī)制。研究利用TCMSP、STITCH和SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)篩選木犀草素的潛在靶點(diǎn)；從DisGeNET、GeneCards和TTD數(shù)據(jù)庫(kù)收集特應(yīng)性皮炎相關(guān)靶點(diǎn)；通過(guò)STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)和Cytoscape 3.9.0軟件構(gòu)建交集靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)；進(jìn)行GO和KEGG富集分析以明確木犀草素抗特應(yīng)性皮炎的關(guān)鍵通路；在2,4-二硝基氟苯誘導(dǎo)的特應(yīng)性皮炎小鼠模型中，驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)的治療效果、候選靶點(diǎn)及信號(hào)通路。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證顯示，木犀草素可改善特應(yīng)性皮炎樣皮膚癥狀，表現(xiàn)為SCORAD評(píng)分降低、肥大細(xì)胞浸潤(rùn)減少及皮膚屏障功能恢復(fù)；此外，木犀草素通過(guò)調(diào)節(jié)Th1/Th2/Th17介導(dǎo)的細(xì)胞因子產(chǎn)生恢復(fù)免疫平衡，且抑制病變皮膚中JAK2和STAT3的磷酸化。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相結(jié)合的方式，系統(tǒng)闡明了木犀草素改善特應(yīng)性皮炎的作用及可能的分子機(jī)制，為木犀草素的后續(xù)開(kāi)發(fā)及臨床應(yīng)用提供了參考。

研究材料與儀器

材料

2,4-二硝基氟苯、木犀草素、地塞米松、丙酮、橄欖油、乙醇、丙二醇、4%多聚甲醛、蘇木精-伊紅染色液、甲苯胺藍(lán)染色液、BCA蛋白定量試劑盒、Th1/Th2/Th17相關(guān)細(xì)胞因子ELISA試劑盒、兔抗FLG、抗p-JAK2、抗p-STAT3一抗、山羊抗兔IgG二抗、DAB染色液、DAPI染色液

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：6周齡雌性KM小鼠

儀器

ASCH VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測(cè)量?jī)x、游標(biāo)卡尺、分析天平、組織包埋機(jī)、切片機(jī)、光學(xué)顯微鏡、酶標(biāo)儀、離心機(jī)、免疫組化染色相關(guān)設(shè)備、免疫熒光成像設(shè)備

ASCH VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測(cè)量?jī)x

過(guò)程

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1. 靶點(diǎn)篩選：通過(guò)TCMSP、STITCH 4.0和SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)獲取木犀草素的潛在靶點(diǎn)，經(jīng)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)注釋并標(biāo)準(zhǔn)化基因符號(hào)，去除重復(fù)及非人類靶點(diǎn)；以“Dermatitis, Atopic"為關(guān)鍵詞，從DisGeNET、GeneCards和TTD數(shù)據(jù)庫(kù)篩選特應(yīng)性皮炎相關(guān)靶點(diǎn)，去除重復(fù)靶點(diǎn)。

2. 交集靶點(diǎn)獲?。豪肰enny 2.1.0在線工具獲取木犀草素與特應(yīng)性皮炎的交集靶點(diǎn)，即木犀草素抗特應(yīng)性皮炎的潛在靶點(diǎn)。

3. PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與拓?fù)浞治觯簩⒔患悬c(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)并導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0軟件可視化；通過(guò)CytoHubba插件篩選“Degree"值前20的核心靶點(diǎn)，利用MCODE插件進(jìn)行模塊分析。

4. GO與KEGG富集分析：將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)和OmicShare云平臺(tái)，進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析，篩選Q值＜0.01的條目，可視化前20項(xiàng)結(jié)果。

分子對(duì)接驗(yàn)證

1. 從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)下載木犀草素的3D結(jié)構(gòu)，經(jīng)PyMOL軟件加氫、加電荷后保存為.pdbqt格式。

2. 從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)獲取核心靶點(diǎn)的X射線晶體結(jié)構(gòu)，通過(guò)UCSF Chimera 1.14軟件去除配體和水分子，添加極性氫原子和Gasteiger電荷。

3. 以木犀草素為配體、核心靶點(diǎn)為受體，利用UCSF Chimera 1.14軟件進(jìn)行分子對(duì)接，以結(jié)合能評(píng)價(jià)結(jié)合能力。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1. 動(dòng)物分組與特應(yīng)性皮炎模型構(gòu)建：小鼠適應(yīng)飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為4組：正常組、模型組、0.5%木犀草素組、0.05%地塞米松組。建模方法：第1天在小鼠背部脫毛區(qū)涂抹100μL 1.0% DNFB致敏；第3、7、11天涂抹100μL 0.5% DNFB激發(fā)；從第1天至第13天，木犀草素組和地塞米松組每日背部涂抹對(duì)應(yīng)藥物，正常組和模型組涂抹等體積溶媒。

2. 指標(biāo)檢測(cè)：

第13天進(jìn)行SCORAD評(píng)分（評(píng)估紅斑/出血、鱗屑/干燥、水腫/腫脹、糜爛/抓痕，評(píng)分0-3分/項(xiàng)），計(jì)數(shù)10分鐘內(nèi)搔抓次數(shù)；第12天用ASCH VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測(cè)量?jī)x檢測(cè)TEWL值。

小鼠處死后，分離背部皮膚，用游標(biāo)卡尺測(cè)厚度、分析天平測(cè)重量；取皮膚組織固定于4%多聚甲醛，包埋切片后進(jìn)行H&E染色（檢測(cè)表皮厚度和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)）、TB染色（檢測(cè)肥大細(xì)胞浸潤(rùn)），ImageJ軟件定量分析。

收集小鼠眼球血，離心獲取血清；取100mg皮膚組織勻漿后離心獲取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度，ELISA試劑盒檢測(cè)血清和皮膚中Th1/Th2/Th17相關(guān)細(xì)胞因子水平。

皮膚組織切片經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復(fù)等步驟后，進(jìn)行免疫組化和免疫熒光，ImageJ軟件分析平均光密度。

3. 統(tǒng)計(jì)分析：采用GraphPad Prism 5.0軟件，通過(guò)單因素方差分析結(jié)合Dunnett事后檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)，P＜0.05或P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)論

木犀草素與特應(yīng)性皮炎存在 31 個(gè)交集靶點(diǎn)，核心涵蓋 IL-6、TNF、IL-10、VEGFA、IL-4 等 20 個(gè)關(guān)鍵基因，這些靶點(diǎn)主要參與細(xì)胞因子應(yīng)答及相關(guān)信號(hào)通路，且 KEGG 富集分析明確其抗特應(yīng)性皮炎的關(guān)鍵通路包括 IL-17 信號(hào)通路、Th17/Th1/Th2 細(xì)胞分化、JAK/STAT 信號(hào)通路等，分子對(duì)接也驗(yàn)證了木犀草素與核心靶點(diǎn)的強(qiáng)結(jié)合能力。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，木犀草素能改善 DNFB 誘導(dǎo)的特應(yīng)性皮炎小鼠模型的皮膚癥狀，不僅降低 SCORAD 評(píng)分、減少搔抓次數(shù)、減輕皮膚水腫（降低皮膚厚度和重量），還能改善組織病理學(xué)改變，減少表皮增生和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，降低顆粒型與脫顆粒型肥大細(xì)胞的浸潤(rùn)數(shù)量；同時(shí)，它可有效恢復(fù)皮膚屏障功能，表現(xiàn)為降低 TEWL 值、上調(diào) FLG 蛋白表達(dá)，還能調(diào)節(jié)免疫平衡，降低 Th2 相關(guān)細(xì)胞因子 IL-4 及 Th17 相關(guān)細(xì)胞因子 IL-6、TNF-α、IL-17 的水平，升高 Th1 相關(guān)細(xì)胞因子 IFN-γ 的水平。而這一系列作用的核心機(jī)制在于木犀草素能抑制 JAK2 和 STAT3 的磷酸化，阻斷 JAK/STAT 信號(hào)通路激活，為特應(yīng)性皮炎的臨床治療提供了重要科學(xué)依據(jù)與潛在方向。